關(guān)于ELISA試劑盒操作中顯色以及比色的相關(guān)知識(shí)介紹
點(diǎn)擊次數(shù)：748 更新時(shí)間：2019-05-15
關(guān)于ELISA試劑盒操作中顯色以及比色的相關(guān)知識(shí)介紹
ELISA試劑盒憑借著其優(yōu)異的產(chǎn)品性能，在檢測(cè)抗體、抗原等方面都有很廣泛的應(yīng)用，并越來越受到廣大用戶的喜愛，然而在實(shí)際操作中，有很多需要我們?nèi)ブ匾暤膯栴}，尤其是顯色以及比色問題，接下來小編簡(jiǎn)單為大家做一個(gè)介紹。
1、顯色：顯色是ELISA中的后一步溫育反應(yīng)，此時(shí)酶催化無色的底物生成有色的產(chǎn)物，反應(yīng)的溫度和時(shí)間仍是影響顯色的因素，在一定時(shí)間內(nèi)，陰性孔可保持無色，而陽(yáng)性孔則隨時(shí)間的延長(zhǎng)而呈色加強(qiáng)，適當(dāng)提高溫度有助于加速顯色進(jìn)行，在定量測(cè)定中，加入底物后的反應(yīng)溫度和時(shí)間應(yīng)按規(guī)定力求準(zhǔn)確。定性測(cè)定的顯色可在室溫進(jìn)行，時(shí)間一般不需要嚴(yán)格控制，有時(shí)可根據(jù)陽(yáng)性對(duì)照孔和陰性對(duì)照孔的顯色的情況適當(dāng)縮短或延長(zhǎng)反應(yīng)時(shí)間，及時(shí)判斷。
OPD（鄰笨二胺）底物顯色一般在室外溫或37℃反應(yīng)20-30分鐘后即不再加深，再延長(zhǎng)反應(yīng)時(shí)間，可使本底值增高。OPD底物液受光照會(huì)自行變色，顯色反應(yīng)應(yīng)避光進(jìn)行，ELISA試劑盒顯色反應(yīng)結(jié)束時(shí)加入終止液終止反應(yīng)。OPD產(chǎn)物用硫酸終止后，顯色由橙黃色轉(zhuǎn)向棕黃色。
TMB（四甲基聯(lián)笨胺）受光照的影響不大，可在室溫中置于操作臺(tái)上，邊反應(yīng)觀察結(jié)果。但為保證實(shí)驗(yàn)結(jié)果的穩(wěn)定性，宜在規(guī)定的適當(dāng)時(shí)間閱讀結(jié)果。TMB經(jīng)HRP作用后，約40分鐘顯色達(dá)，隨即逐漸減弱，至2小時(shí)后即可*消退至無色。TMB的終止液有多種，疊氮鈉和十二烷基硫酸鈉（SDS）等酶抑制劑均可使反應(yīng)終止。這類終止劑尚能使藍(lán)色維持較長(zhǎng)時(shí)間（12-24小時(shí)）不褪，是目視判斷的良好終止劑。此外，各類酸性終止液則會(huì)使藍(lán)色轉(zhuǎn)變成黃色，此時(shí)可用特定的波長(zhǎng)（450nm）測(cè)讀吸光值。
2、比色：比色前應(yīng)先用潔凈的吸水紙拭干板底附著的液體，然后將板正確放入酶標(biāo)比色儀的比色架中。以軟板為載體的試驗(yàn)，需先將板置于標(biāo)準(zhǔn)96孔的座架中，才可進(jìn)行比色。可在加底物液顯色前，先將軟板邊緣剪凈，這樣，此板就可*平妥坐入座架中。
比色時(shí)應(yīng)先以蒸餾水校零點(diǎn)，測(cè)讀底物孔（未經(jīng)任何反應(yīng)僅加底物液的孔）和空白孔（以生理鹽水或稀釋液代替標(biāo)本作全過程的孔），以記錄本次試驗(yàn)的試劑狀況。其后可用空白孔以蒸餾水校零點(diǎn)，以上各孔的吸光度需減去空白孔的吸光度，然后進(jìn)行計(jì)算。
比色結(jié)果的表達(dá)以往通用光密度（oplical density，OD），現(xiàn)按規(guī)定用吸光度（absorbence，A），兩者含義相同。通常的表示方法是，將吸收波長(zhǎng)寫于A字母的右下角，如OPD的吸收波長(zhǎng)為492nm，表示方法為“A492nm"或“OD492nm"。
