商品屬性：

描述：

Ni-NTA Resin 是用于純化 6×His 標簽重組蛋白的一種純化介質，它是由 4%交聯(lián)的 Sepharose 耦連了一種四齒螯合劑 NTA 而得. 它可用于在非變性或變性條件下純化任何表達系統(tǒng)表達的 6xHis 標簽重組蛋白。NTA，含有四個螯合區(qū)，較一般的三齒螯合劑能更好的結合 Ni2+。6×His 可與 Ni2+螯合，從而使 His 標簽蛋白結合在 Ni-NTA 純化介質上，未結合的蛋白被洗滌下去，結合在介質上的蛋白經過一定濃度的咪唑或低 PH 緩沖液被溫和的洗脫下來，從而得到高純度的目的蛋白。
主要特征
該純化介質與 His 標簽蛋白具有的親和力，可達5-20 mg/ml。
可在非變性和變性條件下純化任何表達系統(tǒng)所得的 His標簽蛋白。
純化程序簡單，所得的蛋白純度可高達 95％。
Ni-NTA 可再生 4-6 次，重復使用。
組成：50％的懸浮液（20％乙醇），已螯合 Ni2+。
應用
His 標簽蛋白的純化。
蛋白結構與功能研究。
蛋白-蛋白以及蛋白-DNA 之間相互作用的研究。
配體-受體之間相互作用的研究。
儲存：4℃保存，可保存 2 年。
操作方法
A. 非變性條件下抽提 His 標簽蛋白
1. 樣品準備
1) 準備細胞，接種，誘導表達。對于實驗室用的 pET 載體表達系列，在細胞 OD600=0.5-0.8 時，用 1 mM IPTG 誘導 1-3 小時，可以獲得理想的表達效率。收集細胞，置于-70°C或立即進行步驟 2 操作。
2) 加入 1/20 細胞生長體積的 NTA-0 Buffer (20 mMTris-HCl pH7.9, 0.5 M NaCl,10% Glycerol)和 1 mM PMSF。
注意：PMSF 見水分解，需要在使用前加入。
3) 將細胞懸浮起來，超聲或勻漿破碎細胞。該步驟冰上操作。
4) 加入 10% Triton X-100, 使終濃度為 0.05%，充分混勻，冰上放置 15 分鐘。
5) 13,000 轉/分(20,000xg 以上)，4°C 離心 15min。取上清，置于冰上備用或-20°C 保存。
2. 層析
1) 將 NTA 樹脂裝入合適的層析柱，層析用 10 倍 NTA 體積的 NTA-0 Buffer 平衡填料。
2) 將上清樣品加至 NTA 層析柱中，流速在 15 ml/h 左右，收集穿透部分，用于 SDS/PAGE 分析蛋白質的結合情況。
3) 層析用 5 倍 NTA 體積的 NTA-0 Buffer 洗滌填料，流速控制在 30 ml/h 左右。
4) 再分別用 5 倍 NTA 體積的 NTA-20、NTA-50、NTA-100、NTA-250 洗脫填料，流速控制在 15 ml/h 左右，收集洗脫液，每管收集一個 NTA 體積。
5) 確定目標蛋白質在洗脫液中的分布情況。最為有效的方式是 SDS/PAGE 分析。也可以用 Bradford 蛋白質測定試劑盒，快速確定蛋白質的含量，然后用 SDS/PAGE 分析蛋白質的分布。
6) 目標蛋白質需要進一步純化需要根據(jù)蛋白質的用途確定。純化的目標蛋白質的保存條件需要根據(jù)蛋白質的性質和用途確定。
3. 溶液配方
NTA-0 Buffer:
20 mM Tris-HCl pH7.9, 0.5 M NaCl, 10% Glycerol,
NTA-20 Buffer:
20 mM Tris-HCl pH7.9, 0.5 M NaCl, 10% Glycerol,
20 mM Imidazole(咪唑)
NTA-50 Buffer:
20 mM Tris-HCl pH7.9, 0.5 M NaCl, 10% Glycerol,

PCR基本步驟及注意事項？

一、實驗原理

PCR是體外人工選擇性擴增DNA的一種方法，它類似于生物體內DNA的復制。在生物體內DNA復制需要模板、引物、DNA聚合酶、DNA解旋酶、 dNTPs；而體外PCR反應同樣需要類似的成分，有模板、引物、PCR Buffer、Taq酶、dNTPs。其中引物是人工設計的特定序列，實現(xiàn)對特定位置的擴增；PCR Buffer提供一個反應的緩沖環(huán)境；反應過程同生物體內一樣，DNA雙鏈打開，引物結合模板，延伸形成新鏈。而這些過程在生物體內靠DNA解旋酶解鏈，而在體外在通過控制反應溫度實現(xiàn)的。如常用94℃變性模板DNA打開雙鏈，在退火溫度處引物結合到模板上，最后在72℃完成延伸，并反復重復此過程即可實現(xiàn)對特定片段DNA的大量擴增。到第三循環(huán)開始才產生出和靶DNA區(qū)段相同的DNA分子，進一步循環(huán)地產生出靶DNA區(qū)段的指數(shù)加倍。

在擴增后期,由于產物積累,使原來呈指數(shù)擴增的反應變成平坦的曲線,產物不再隨循環(huán)數(shù)而明顯上升,這稱為平臺效應。平臺期(Plateau)會使原先由于錯配而產生的低濃度非特異性產物繼續(xù)大量擴增，達到較高水平。因此，應適當調節(jié)循環(huán)次數(shù)，在平臺期前結束反應， 減少非特異性產物。到達平臺期(Plateau)所需循環(huán)次數(shù)取決于樣品中模板的拷貝。

二、主要的成分

1.模板可以是多種形式，主要包括基因組DNA、質粒DNA、攜帶病毒的基因組DNA、PCR產物，cDNA等，但不能為RNA。對于不同類型的模板，其主要不同在于預變性的時間以及模板的量。一般對于大的基因組DNA預變性時間10min足夠，質粒DNA2min、攜帶病毒的基因組DNA預變性2min、PCR產物預變性2min即可。

注意cDNA為單鏈DNA，但仍可做PCR的模板，只不過在第一輪循環(huán)時只有一個引物結合，合成另一條鏈。從第二輪開始，兩個引物均與特異位點結合，從而實現(xiàn)了與常規(guī)PCR的接軌。而同作為單鏈的RNA卻不能進行PCR擴增，原因就在于實現(xiàn)PCR反應的是DNA聚合酶，只能特意識別DNA鏈。

2.對于模版的量來說，一般25ul體系DNA的質量為50—100ng。對于基因組DNA由于其結構比較復雜，提取的濃度也往往比較大，為防止?jié)舛冗^大對PCR造成影響，故需對提取的DNA進行梯度稀釋。否則濃度過高則可能會引起非特異性擴增。對于質粒及PCR產物由于其結構簡單，且提取濃度一般較低，則無需稀釋。

PCR實驗中應該注意的問題有哪些?

沒有ct值

檢測結果遇到沒有Ct值情況,排查是否有以下問題:

1、循環(huán)數(shù)不夠(一般不超過45循環(huán),不僅背景值提高,定量也不準);

2、PCR程序設置錯誤,檢測熒光信號的步驟有誤。一般SG法采用72℃延伸時采集,TaqMan法則一般在退火結束時或延伸時采集信號,另外熒光采集是否選中;

3、引物或探針降解。可通過PAGE電泳檢測引物和探針是否降解;

4、模板量可能降解或上樣量不足(不超過500ng,根據(jù)試劑盒說明書即可), 對未知濃度的樣本應從系列稀釋樣本的最高濃度做起;如果發(fā)生模板降解,應考慮樣本準備中雜質的引入及反復凍融的情況,建議將模板樣本小量分裝儲備,避免反復凍融;

5、引物探針是否合適(尤其是引物跨越內含子,以確保擴增基因組DNA;上下游引物Tm值超過4℃以上也會影響擴增)。

ct值過晚

在相對定量中, Ct值一般控制在15—25之間比較好,如果在絕對定量中, 對低拷貝數(shù)的樣品,Ct值會增大, 但是一般不宜超過40循環(huán), 否則定量不準確。

因此,判斷Ct值出現(xiàn)過晚是否屬于非正常情況, 需要根據(jù)具體實驗設計和目的進行。

1、擴增效率低。引物之間或者引物和探針的比例不合適, 需要進行優(yōu)化;引物或探針設計不合理, 需要重新設計;

2、PCR程序不合適, 改用三步法進行反應, 或者優(yōu)化退火/延伸溫度, 可以適當降低退火溫度; 退火/延伸時間短(可以在推薦的時間條件下延長10s);

3、MgCl2濃度不合適,增加鎂離子濃度等。PCR各種反應成分的降解或加樣量的不足;

4、PCR產物太長。PCR產物設計超過500bp;

5、模板中存在抑制物。用高純度模板進行PCR檢測或將模板進行稀釋。

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