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    Murine Rnase inhibitor(40U/ul)

    簡要描述:

    Murine Rnase inhibitor(40U/ul)公司正在出售的產品:人前列腺細胞 蛋白體激活因子PA28γ封閉多肽 伯克氏菌通用PCR檢測試劑盒 大鼠趨化因子(fractalkine/CX3CL1)ELISA Kit 亮氨氨基肽(LAP)活性比色法檢測試劑盒 中國黃海菌 2號染色體開放閱讀框57抗體

    更新時間:2024-01-12

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    Murine Rnase inhibitor(40U/ul)

    商品屬性:

    產品名稱

    規(guī)格

    貨號

    Murine Rnase inhibitor(40U/ul)

    4000U

    A-PJ1051


    描 述 :

    本產品系重組表達得到的鼠源 RNA 酶抑制劑,可與 RNase 非共價結合,形成 1:1 的復合物,具有廣譜的 RNase 抑制活性。相比于人源 Rnase Inhibitor,鼠源抑制劑對還原 劑不敏感。 

    單位定義:抑制 5 ng RNase A 的 50%活性所需的 RNaseInhibitor 量定義為一個活性單位。
    應用:
    cDNA 合成反應
    體外無細胞系統(tǒng)轉錄或翻譯提高多聚核糖體的產量和活性
    儲存:-20°C 可保存 2 年。
    QQ截圖20240110094643.jpg使用方法
    1. 按以下組分配制反應體系
    Golden MLV Reverse Transcriptase 0.5-1 μl
    10×RT Buffer 2 μl
    dNTP Mixture (10 mM each) 1 μl
    Total RNA or Poly(A) RNA 0.1-2 μg
    20×Oligo dT(25)&Random Primer * 1 μl
    Murine RNase Inhibitor (40 U/μl) 0.5 μl
    RNase Free H2O Up to 20 μl
    *注:Oligo dT(15)使用濃度為 20~50μM, 如使用 Random9隨機引物可使用 125μM,基因特異性引物可使用 5μM。
    2.在 PCR 儀上按下列條件進行反轉錄反應
     30°C 15 min
     55°C 30~60 min
     85°C 10 min
     4°C
    3. 反轉錄所得的 cDNA 可直接用于 PCR 反應或儲存于-20°C。

    65.jpg

    67.jpg


    PCR基本步驟及注意事項?

    一、實驗原理

    PCR是體外人工選擇性擴增DNA的一種方法,它類似于生物體內DNA的復制。在生物體內DNA復制需要模板、引物、DNA聚合酶、DNA解旋酶、 dNTPs;而體外PCR反應同樣需要類似的成分,有模板、引物、PCR Buffer、Taq酶、dNTPs。其中引物是人工設計的特定序列,實現(xiàn)對特定位置的擴增;PCR Buffer提供一個反應的緩沖環(huán)境;反應過程同生物體內一樣,DNA雙鏈打開,引物結合模板,延伸形成新鏈。而這些過程在生物體內靠DNA解旋酶解鏈,而在體外在通過控制反應溫度實現(xiàn)的。如常用94℃變性模板DNA打開雙鏈,在退火溫度處引物結合到模板上,最后在72℃完成延伸,并反復重復此過程即可實現(xiàn)對特定片段DNA的大量擴增。到第三循環(huán)開始才產生出和靶DNA區(qū)段相同的DNA分子,進一步循環(huán)地產生出靶DNA區(qū)段的指數(shù)加倍。

    在擴增后期,由于產物積累,使原來呈指數(shù)擴增的反應變成平坦的曲線,產物不再隨循環(huán)數(shù)而明顯上升,這稱為平臺效應。平臺期(Plateau)會使原先由于錯配而產生的低濃度非特異性產物繼續(xù)大量擴增,達到較高水平。因此,應適當調節(jié)循環(huán)次數(shù),在平臺期前結束反應, 減少非特異性產物。到達平臺期(Plateau)所需循環(huán)次數(shù)取決于樣品中模板的拷貝。

    二、主要的成分

    1.模板可以是多種形式,主要包括基因組DNA、質粒DNA、攜帶病毒的基因組DNA、PCR產物,cDNA等,但不能為RNA。對于不同類型的模板,其主要不同在于預變性的時間以及模板的量。一般對于大的基因組DNA預變性時間10min足夠,質粒DNA2min、攜帶病毒的基因組DNA預變性2min、PCR產物預變性2min即可。

    注意cDNA為單鏈DNA,但仍可做PCR的模板,只不過在第一輪循環(huán)時只有一個引物結合,合成另一條鏈。從第二輪開始,兩個引物均與特異位點結合,從而實現(xiàn)了與常規(guī)PCR的接軌。而同作為單鏈的RNA卻不能進行PCR擴增,原因就在于實現(xiàn)PCR反應的是DNA聚合酶,只能特意識別DNA鏈。

    2.對于模版的量來說,一般25ul體系DNA的質量為50—100ng。對于基因組DNA由于其結構比較復雜,提取的濃度也往往比較大,為防止?jié)舛冗^大對PCR造成影響,故需對提取的DNA進行梯度稀釋。否則濃度過高則可能會引起非特異性擴增。對于質粒及PCR產物由于其結構簡單,且提取濃度一般較低,則無需稀釋。

    PCR實驗中應該注意的問題有哪些?

    沒有ct值

    檢測結果遇到沒有Ct值情況,排查是否有以下問題:

    1、循環(huán)數(shù)不夠(一般不超過45循環(huán),不僅背景值提高,定量也不準);

    2、PCR程序設置錯誤,檢測熒光信號的步驟有誤。一般SG法采用72℃延伸時采集,TaqMan法則一般在退火結束時或延伸時采集信號,另外熒光采集是否選中;

    3、引物或探針降解。可通過PAGE電泳檢測引物和探針是否降解;

    4、模板量可能降解或上樣量不足(不超過500ng,根據(jù)試劑盒說明書即可), 對未知濃度的樣本應從系列稀釋樣本的最高濃度做起;如果發(fā)生模板降解,應考慮樣本準備中雜質的引入及反復凍融的情況,建議將模板樣本小量分裝儲備,避免反復凍融;

    5、引物探針是否合適(尤其是引物跨越內含子,以確保擴增基因組DNA;上下游引物Tm值超過4℃以上也會影響擴增)。

    ct值過晚

    在相對定量中, Ct值一般控制在15—25之間比較好,如果在絕對定量中, 對低拷貝數(shù)的樣品,Ct值會增大, 但是一般不宜超過40循環(huán), 否則定量不準確。

    因此,判斷Ct值出現(xiàn)過晚是否屬于非正常情況, 需要根據(jù)具體實驗設計和目的進行。

    1、擴增效率低。引物之間或者引物和探針的比例不合適, 需要進行優(yōu)化;引物或探針設計不合理, 需要重新設計;

    2、PCR程序不合適, 改用三步法進行反應, 或者優(yōu)化退火/延伸溫度, 可以適當降低退火溫度; 退火/延伸時間短(可以在推薦的時間條件下延長10s);

    3、MgCl2濃度不合適,增加鎂離子濃度等。PCR各種反應成分的降解或加樣量的不足;

    4、PCR產物太長。PCR產物設計超過500bp;

    5、模板中存在抑制物。用高純度模板進行PCR檢測或將模板進行稀釋。

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